Microchemical Journal | 我室姚伟团队建立了新的甘蔗病原菌检测方法

近日，广西大学姚伟团队在 Microchemical Journal 在线发表了题为“Cas-mCfLAMP: A multiplex rapid visualization assay for sugarcane pathogens based on labeled LAMP and CRISPR/Cas12a”的研究论文。建立了一种新的甘蔗病原菌检测方法（Cas-mCfLAMP），并证明了其在甘蔗病害检测中的适应性。

甘蔗是一种热带和亚热带的无性繁殖作物，是重要的糖料作物和可再生能源作物，世界上有将近 80%的糖和 40%的生物燃料是由甘蔗生产的。然而，甘蔗的生产和利用受到了多种病害的严重影响，其中甘蔗梢腐病是一种常见且危害严重的甘蔗病害，主要由两种镰刀菌 gx1 和 gx2 引起。甘蔗梢腐病会导致甘蔗茎秆变形、叶片枯萎、产量降低和品质下降，给甘蔗产业带来了巨大的经济损失。

为了有效的预防和控制甘蔗梢腐病，需要对其病原菌进行准确和快速的检测。目前，关于病原菌的检测方法已经有相当多的报道，例如常规 PCR 分子检测、数字 PCR、荧光定量 PCR、生物接种法、电子显微镜法、基于荧光的免疫测定、基于抗体的血清诊断等。然而，这些方法大多存在检测时间长、特异性差、依赖专业技术人员操作昂贵设备和复杂流程等局限性，不适合于现场快速检测植物病原菌。此外，由于甘蔗梢腐病的病原菌复杂多样，仅依靠单一靶基因的分子检测很难准确反映甘蔗的病情，需要对多个靶基因进行同时检测。

Cas-mCfLAMP 解 除 了 Cpf1-LAMP 对 CrRNA 的高度依赖，在单一病害检测中，一次反应便可以检测多重致病菌，在多种病害检测中，无需重新制备特异的 CrRNA， 仅需更换 LAMP 引物便可以实现多种病害的检测。 Cas-mCfLAMP 通过标记LAMP 进行核酸扩增，其最低检测浓度低至 30 copies/μL，其高度的特异性分别在甘蔗黑穗病、甘蔗白条病、甘蔗赤腐病的检测中得到了验证。该研究中还构建了田间检测体系，无需专业的技术人员和昂贵的设备器械，便可以实现甘蔗病原菌的田间可视化检测。

与传统的 Cpf1-LAMP 方法依靠不同的 CrRNA 来检测不同的目标序列不同，Cas-mCfLAMP 利用 LAMP的成环机制将 CrRNA 识别序列引入扩增产物的茎环中。这使得一个 CrRNA 序列可以同时检测多个目标基因，减少了对 CrRNA 的依赖和成本。Cas-mCfLAMP 比 PCR 和 qPCR 具有更低的检测限，并且在区分不同病原体方面表现出高特异性。该研究中还构建了一个多重 LAMP 反应系统，通过使用两个标记的引物组和一个 CrRNA 序列，可以同时检测两个目标基因。

为了便于现场检测结果的可视化，论文中开发了一个简单而便携的平台，该平台使用了固体核酸释放剂、可加热的保温杯、注射器移液装置和侧向流动试纸条。论文中用这个平台测试了 15 个田间样本，在不需要任何样本纯化或技术背景的前提下，60 分钟内（包括操作和反应时间）即可获得了准确的病害诊断结果。总之，这项工作为植物病原体诊断领域做出了新突破，提供了一种全新的多重快速可视化检测技术，突破了传统 Cpf1-LAMP 检测方法对 CrRNA 序列的依赖，实现了对多个目标基因的一次性检测，并降低了 Cpf1-LAMP 在植物病原体检测领域的检测成本。

广西大学姚伟教授、张木清教授和张积森教授为论文的通讯作者，硕士研究生朱理祥为论文的第一作者。论文地址: https://doi.org/10.1016/j.microc.2024.109993